Uptake mechanism, intracellular trafficking and endo-lysosomal pH monitoring of polystyrene nanoparticles

What is the intracellular fate of nanoparticles (NPs) taken up by the cells? This question has been investigated for polystyrene NPs of different sizes with a set of molecular biological and biophysical techniques.rnTwo sets of fluorescent NPs, cationic and non-ionic, were synthesized with three different polymerization techniques. Non-ionic particles (132 – 846 nm) were synthesized with dispersion polymerization in an ethanol/water solution. Cationic NPs with 120 nm were synthesized by miniemulsion polymerization Particles with 208, 267 and 603 nm were produced by seeding the 120 nm particle obtained by miniemulsion polymerization with drop-wise added monomer and polymerization of such. The colloidal characterization of all particles showed a comparable amount of the surface groups. In addition, particles were characterized with regard to their size, morphology, solid content, amount of incorporated fluorescent dye and zeta potential. The fluorescent intensities of all particles were measured by fluorescence spectroscopy for calibration in further cellular experiments. rnThe uptake of the NPs to HeLa cells after 1 – 24 h revealed a much higher uptake of cationic NPs in comparison to non-ionic NPs. If the same amount of NPs with different sizes is introduced to the cell, a different amount of particles is present in the cell medium, which complicates a comparison of the uptake. The same conclusion is valid for the particles’ overall surface area. Therefore, HeLa cells were incubated with the same concentration, amount and surface area of NPs. It was found that with the same concentration always the same polymer amount is taking up by cells. However, the amount of particles taken up decreases for the biggest. A correlation to the surface area could not be found. We conclude that particles are endocytosed by an excavator-shovel like mechanism, which does not distinguish between different sizes, but is only dependent on the volume that is taken up. For the decreased amount of large particles, an overload of this mechanism was assumed, which leads to a decrease in the uptake. rnThe participation of specific endocytotic processes has been determined by the use of pharmacological inhibitors, immunocytological staining and immunofluorescence. The uptake of NPs into the endo-lysosomal machinery is dominated by a caveolin-mediated endocytosis. Other pathways, which include macropinocytosis and a dynamin-dependent mechanism but exclude clathrin mediated endocytosis, also occur as competing processes. All particles can be found to some extent in early endosomes, but only bigger particles were proven to localize in late endosomes. No particles were found in lysosomes; at least not in lysosomes that are labeled with Lamp1 and cathepsin D. However, based on the character of the performed experiment, a localization of particles in lysosomes cannot be excluded.rnDuring their ripening process, vesicles undergo a gradual acidification from early over late endosomes to lysosomes. It is hypothesized that NPs in endo-lysosomal compartments experience the same change in pH value. To probe the environmental pH of NPs after endocytosis, the pH-sensitive dye SNARF-4F was grafted onto amino functionalized polystyrene NPs. The pH value is a ratio function of the two emission wavelengths of the protonated and deprotonated form of the dye and is hence independent of concentration changes. The particles were synthesized by the aforementioned miniemulsion polymerization with the addition of the amino functionalized copolymer AEMH. The immobilization of SNARF-4F was performed by an EDC-coupling reaction. The amount of physically adsorbed dye in comparison to covalently bonded dye was 15% as determined by precipitation of the NPs in methanol, which is a very good solvent for SNARF-4F. To determine influences of cellular proteins on the fluorescence properties, a intracellular calibration fit was established with platereader measurements and cLSM imaging by the cell-penetrable SNARF-4F AM ester. Ionophores equilibrated the extracellular and intracellular pH.rnSNARF-4F NPs were taken up well by HeLa cells and showed no toxic effects. The pH environment of SNARF-4F NPs has been qualitatively imaged as a movie over a time period up to 1 h in pseudo-colors by a self-written automated batch program. Quantification revealed an acidification process until pH value of 4.5 over 24 h, which is much slower than the transport of nutrients to lysosomes. NPs are present in early endosomes after min. 1 h, in late endosomes at approx. 8 h and end up in vesicles with a pH value typical for lysosomes after > 24 h. We therefore assume that NPs bear a unique endocytotic mechanism, at least with regards to the kinetic involvedrn

90 Nb: potential radionuclide for application in immuno-PET : development of appropriate production strategy and first in vivo evaluation of 90 Nb-labeled monoclonal antibody

Die Nuklearmedizin ist ein modernes und effektives Werkzeug zur Erkennung und Behandlung von onkologischen Erkrankungen. Molekulare Bildgebung, die auf dem Einsatz von Radiopharmaka basiert, beinhaltet die Einzel-Photonen-Emissions-Tomographie (SPECT) und Positronenemissions¬tomographie (PET) und ermöglicht die nicht-invasive Visualisierung von Tumoren auf nano-und picomolarer Ebene.rnDerzeit werden viele neue Tracer für die genauere Lokalisierung von kleinen Tumoren und Metastasen eingeführt und hinsichtlich ihrer Eignung untersucht. Die meisten von ihnen sind Protein-basierte Biomoleküle, die die Natur selbst als Antigene für die Tumorzellen produziert. Dabei spielen Antikörper und Antikörper-Fragmente eine wichtige Rolle in der Tumor-Diagnostik und Behandlung. Die PET-Bildgebung mit Antikörpern und Antikörperfragmenten bezeichnet man als immuno-PET. Ein wichtiger Aspekt hierbei ist, dass entsprechende Radiopharmaka benötigt werden, deren Halbwertszeit mit der Halbwertszeit der Biomoleküle korreliert ist.rnIn neueren Arbeiten wird 90Nb als potenzieller Kandidat für die Anwendung in der immuno-PET vorgeschlagen. Seine Halbwertszeit von 14,6 Stunden ist geeignet für die Anwendung mit Antikörperfragmenten und einige intakten Antikörpern. 90Nb hat eine relativ hohen Anteil an Positronenemission von 53% und eine optimale Energie für die β+-Emission von 0,35 MeV, die sowohl eine hohe Qualität der Bildgebung als auch eine niedrige Aktivitätsmenge des Radionuklids ermöglicht.rnErsten grundlegende Untersuchungen zeigten: i) dass 90Nb in ausreichender Menge und Reinheit durch Protonen-Bombardierung des natürlichen Zirkonium Targets produziert, ii) aus dem Targetmaterial in entsprechender radiochemischer Reinheit isoliert und iii) zur Markierung des monoklonalen Antikörpers (Rituximab) verwendet werden kann und iv) dieser 90Nb-markierte mAb eine hohe in vitro Stabilität besitzt. Desweiteren wurde eine alternative und schnelle Abtrennungsmethode entwickelt, die es erlaubt 90Nb, mit einer geeigneten radiochemischen und radionuklidischen Reinheit für eine anschließende Markierung von Biomolekülen in einer Stunde zu aufzureinigen. Schließlich wurden erstmals 90Nb-markierte Biomolekülen in vivo untersucht. Desweiteren wurden auch Experimente durchgeführt, um den optimalen bifunktionellen Chelatbildner (BFC) für 90Niob zu finden. Mehrere BFC wurden hinsichtlich Komplexbildung mit NbV untersucht. Desferrioxamin (Df) erwies sich als geeignetster Chelator für 90Nb. Der monoklonale Antikörper Bevacizumab (Avastin®) wurde mit 90Nb markiert und eine Biodistributionsstudie und eine PET-Untersuchung durchgeführt. Alle diese Ergebnisse zeigten, dass 90Nb ein vielversprechendes Radionuklid für die Immuno-PET ist, welches sogar für weitere kommerzielle Anwendungen in der klinischen Routine geeignet zu sein scheint.rn

Johannes Driessler - Leben und Werk

Die vorliegende Arbeit über den Komponisten Johannes Driessler besteht aus einer Biographie, Werkanalysen und einem Werkverzeichnis inklusive Verlagsangaben. Johannes Driessler - geboren am 26. Januar 1921 in Friedrichsthal, gestorben am 4. Mai 1998 in Detmold - entfaltet, neben seiner pädagogischen Tätigkeit als Kompositionslehrer an der Nordwestdeutschen Musikakademie in Detmold, zwischen 1946 und 1971 ein reiches kompositorisches Schaffen. Sein Werk umfaßt geistliche und weltliche Chormusik - A-cappella-Werke, Kantaten, Oratorien, Opern, eine Messe - Liedkompositionen, Kammermusik, Klavier- und Orgelmusik, Orchesterwerke und Symphonien. Johannes Driesslers Werk ist in der geistlichen Musik verwurzelt, er entwickelt eine eigene Tonsprache: Die Gestaltung von Werken aus einer Grundidee, der Bogen, der Ostinato, das Kontrapunktische im Kanon, in der Fuge, in der Passacaglia und eine ungebundene Harmonik sind Elemente seines intellektuellen Kompositionsstils. Johannes Driesslers ureigenes Feld liegt im Vokalbereich. Hier gibt es hervorragende Werke wie zum Beispiel das erste Oratorium Dein Reich komme. Die zyklischen geistlichen Werke durch das Kirchenjahr sind wichtige Bausteine in den Gattungen Orgelmusik und Evangelienspruch im 20. Jahrhundert. Die frühe Kammermusik und die Opern des Komponisten sollten neu entdeckt werden. Auch die didaktisch wertvolle Musik in den Lehrwerken für Schüler und Studierende hat Bestand.

Glukosestoffwechsel und Strahlentherapie solider, maligner Tumoren

Der Tumorstoffwechsel ist charakterisiert durch eine erhöhte Glykolyserate und die Anreicherung von Laktat auch in Anwesenheit von Sauerstoff. In früheren Arbeiten dieser Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass ein hoher Laktatgehalt in Primärtumoren signifikant mit einem gesteigerten Metastasierungsverhalten und einer schlechteren Patientenprognose verknüpft ist. Ein wichtiges Verfahren zur Bestimmung des Metabolitstatus in kryokonservierten Tumorschnitten ist die induzierte, metabolische Biolumineszenz. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neues, digitales Kamerasystem für Biolumineszenzmessungen etabliert. Außerdem wurde der für die Laktat- und Glukosemessungen benötigte Enzymmix optimiert, so dass eine bessere Lichtausbeute und eine Kosteneinsparung von etwa 50% erzielt werden konnte. Durch die Einführung von Kontrollmessungen und die Verwendung eines neu entwickelten ImageJ-PlugIns für eine halbautomatisierte Auswertung, konnte ein zuverlässiges Messsystem etabliert werden, das Ergebnisse mit einer verbesserten Reproduzierbarkeit liefert. rnDieses neue Messsytem wurde in einer Studie an zehn humanen xenotransplantierten Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereiches erfolgreich eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass eine signifikante, positive Korrelation zwischen dem Laktatgehalt in soliden Primärtumoren und der Resistenz gegenüber einer fraktionierten Strahlentherapie besteht. rnIn einer weiterführenden Studie wurde im gleichen Xenograftmodell der Einfluss einer fraktionierten Strahlentherapie auf den Tumorstoffwechsel untersucht. Der Vergleich von zwei humanen Plattenepithelkarzinomlinien des Kopf-Hals-Bereichs im Verlauf einer fraktionierten Strahlentherapie zeigt deutliche Unterschiede zwischen strahlenresistenten und strahlensensiblen Tumoren. In der strahlenempfindlichen Tumorlinie UT-SCC 14 treten nach Bestrahlung mit drei Fraktionen in der Expression glykolyse-assoziierter Gene und nach zehn Fraktionen im ATP- und Laktatgehalt signifikante Veränderungen auf. Im Gegensatz dazu wird bei der strahlenresistenten Linie UT-SCC 5 lediglich eine Absenkung des Laktatgehaltes nach zehn Fraktionen beobachtet, nicht jedoch des ATP-Gehalts. Die mRNA-Expression wird in UT-SCC 5 nicht durch eine fraktionierte Bestrahlung verändert. Diese Ergebnisse liefern erste Hinweise, dass das mRNA-Expressionslevel und der Metabolitgehalt frühe Marker für das Ansprechen auf eine Strahlentherapie sein können.rn

Design of multifunctional magnetic nanomaterials for biomedical applications

Diese Arbeit ist ein Beitrag zu den schnell wachsenden Forschungsgebieten der Nano-Biotechnologie und Nanomedizin. Sie behandelt die spezifische Gestaltung magnetischer Nanomaterialien für verschiedene biomedizinische Anwendungsgebiete, wie beispielsweise Kontrastmittel für die magnetische Resonanztomographie (MRT) oder "theragnostische" Agenzien für simultane optische/MR Detektion und Behandlung mittels photodynamischer Therapie (PDT).rnEine Vielzahl magnetischer Nanopartikel (NP) mit unterschiedlichsten magnetischen Eigenschaften wurden im Rahmen dieser Arbeit synthetisiert und erschöpfend charakterisiert. Darüber hinaus wurde eine ganze Reihe von Oberflächenmodifizierungsstrategien entwickelt, um sowohl die kolloidale als auch die chemische Stabilität der Partikel zu verbessern, und dadurch den hohen Anforderungen der in vitro und in vivo Applikation gerecht zu werden. Diese Strategien beinhalteten nicht nur die Verwendung bi-funktionaler und multifunktioneller Polymerliganden, sondern auch die Kondensation geeigneter Silanverbindungen, um eine robuste, chemisch inerte und hydrophile Siliziumdioxid- (SiO2) Schale um die magnetischen NP auszubilden.rnGenauer gesagt, der Bildungsmechanismus und die magnetischen Eigenschaften monodisperser MnO NPs wurden ausgiebig untersucht. Aufgrund ihres einzigartigen magnetischen Verhaltens eignen sich diese NPs besonders als (positive) Kontrastmittel zur Verkürzung der longitudinalen Relaxationszeit T1, was zu einer Aufhellung im entsprechenden MRT-Bild führt. Tatsächlich wurde dieses kontrastverbessernde Potential in mehreren Studien mit unterschiedlichen Oberflächenliganden bestätigt. Au@MnO „Nanoblumen“, auf der anderen Seite, sind Vertreter einer weiteren Klasse von Nanomaterialien, die in den vergangenen Jahren erhebliches Interesse in der wissenschaftlichen Welt geweckt hat und oft „Nano-hetero-Materialien“ genannt wird. Solche Nano-hetero-partikel vereinen die individuellen physikalischen und chemischen Eigenschaften der jeweiligen Komponenten in einem nanopartikulärem System und erhöhen dadurch die Vielseitigkeit der möglichen Anwendungen. Sowohl die magnetischen Merkmale von MnO, als auch die optischen Eigenschaften von Au bieten die Möglichkeit, diese „Nanoblumen“ für die kombinierte MRT und optische Bildgebung zu verwenden. Darüber hinaus erlaubt das Vorliegen zweier chemisch unterschiedlicher Oberflächen die gleichzeitige selektive Anbindung von Katecholliganden (auf MnO) und Thiolliganden (auf Au). Außerdem wurde das therapeutische Potential von magnetischen NPs anhand von MnO NPs demonstriert, die mit dem Photosensibilisator Protoporhyrin IX (PP) funktionalisiert waren. Bei Bestrahlung mit sichtbarem Licht initiiert PP die Produktion von zytotoxisch-reaktivem Sauerstoff. Wir zeigen, dass Nierenkrebszellen, die mit PP-funktionalisierten MnO NPs inkubiert wurden nach Bestrahlung mit Laserlicht verenden, während sie ohne Bestrahlung unverändert bleiben. In einem ähnlichen Experiment untersuchten wir die Eigenschaften von SiO2 beschichteten MnO NPs. Dafür wurde eigens eine neuartige SiO2-Beschichtungsmethode entwickelt, die einer nachfolgende weitere Anbindung verschiedenster Liganden und die Einlagerung von Fluoreszenzfarbstoffen durch herkömmliche Silan- Sol-Gel Chemie erlaubt. Die Partikel zeigten eine ausgezeichnete Stabilität in einer ganzen Reihe wässriger Lösungen, darunter auch physiologische Kochsalzlösung, Pufferlösungen und humanes Blutserum, und waren weniger anfällig gegenüber Mn-Ionenauswaschung als einfache PEGylierte MnO NPs. Des Weiteren konnte bewiesen werden, dass die dünne SiO2 Schicht nur einen geringen Einfluss auf das magnetische Verhalten der NPs hatte, so dass sie weiterhin als T1-Kontrastmittel verwendet werden können. Schließlich konnten zusätzlich FePt@MnO NPs hergestellt werden, welche die individuellen magnetischen Merkmale eines ferromagnetischen (FePt) und eines antiferromagnetischen (MnO) Materials vereinen. Wir zeigen, dass wir die jeweiligen Partikelgrößen, und damit das resultierende magnetische Verhalten, durch Veränderung der experimentellen Parameter variieren können. Die magnetische Wechselwirkung zwischen beiden Materialien kann dabei auf Spinkommunikation an der Grenzfläche zwischen beiden NP-Sorten zurückgeführt werden.rn